Pseudomonas aeruginosa, ferro, biofilm e quorum sensing: prospettive per nuove terapie

Le infezioni polmonari croniche causate da Pseudomonas aeruginosa sono oggi la principale causa di perdita della funzionalità polmonare nei soggetti affetti da fibrosi cistica (FC). P. aeruginosa provoca infezioni transitorie nel bambino FC fino a 3-5 anni d'età, finché non riesce ad insediarsi nel tratto respiratorio in modo stabile, rimanendovi per tutta la vita del paziente a dispetto delle più avanzate terapie antibiotiche. Il momento in cui l'infezione cronicizza è generalmente contraddistinto da un cambiamento genetico nel batterio, che assume un aspetto (fenotipo) mucoide. Un batterio presenta il fenotipo mucoide quando inizia a produrre elevate quantità di un rivestimento mucoso, sovente costituito da unità ripetute di zuccheri (polisaccaridi). Nei polmoni cronicamente infetti le cellule di P. aeruginosa vivono inglobate in questa sostanza gelatinosa/mucoide, detta alginato. Questo insieme organizzato di batteri e sostanza mucoide si chiama biofilm. E' stato definitivamente accertato che il biofilm protegge cellule batteriche dall'attacco del sistema immunitario e dall'azione degli antibiotici e, per quanto attiene l'infezione da P. aeruginosa, costituisce una caratteristica distintiva dello stadio cronico (Murray et al., 2007).

P. aeruginosa colonizza i polmoni di buona parte dei bambini affetti da FC molto precocemente. Tanto più precocemente avviene la colonizzazione da P. aeruginosa, tanto più bassa sarà l'età in cui si instaura l'infezione cronica. Di questo i medici sono ben consapevoli, tanto che tendono a trattare precocemente con antibiotici i bambini che risultano positivi alla presenza di P. aeruginosa nelle vie aeree, anche in assenza di sintomi. Questo tipo di strategia si è rivelata efficace nel ritardare la colonizzazione, ma purtroppo non evita il successivo instaurarsi dell'infezione e la sua cronicizzazione (Murray et al., 2007).

Gli antibiotici per definizione sono farmaci che hanno come bersaglio alcune funzioni vitali dei batteri. E' ormai assodato come gli antibiotici siano particolarmente efficaci contro la forma non mucoide di P. aeruginosa (fatta eccezione per i ceppi multiresistenti), ma molto meno contro il biofilm. Per combattere l'infezione cronica da P. aeruginosa, ovvero il batterio nel biofilm, si rendono necessarie nuove strategie terapeutiche, complementari o supplementari ai trattamenti antibiotici convenzionali, e mirate specificamente contro il biofilm.

Decenni di ricerca di base hanno permesso di identificare funzioni metaboliche di P. aeruginosa che costituiscono dei bersagli ideali per farmaci anti-biofilm quali la risposta alla carenza di ferro ed il "quorum sensing".

La risposta di P. aeruginosa alla carenza di ferro

Il ferro è un nutriente essenziale per tutte le cellule viventi, compresi i batteri. In linea di massima, per poter essere assimilato dai batteri, il ferro deve trovarsi disciolto in un mezzo acquoso. Alte concentrazioni di ferro in soluzione sono tuttavia tossiche per le cellule. Per questo motivo, nei tessuti e nei liquidi biologici degli animali superiori il ferro è legato a varie proteine (transferrina, lattoferrina, ferritina, emoglobina ecc.), mentre scarseggia il ferro libero e dunque disponibile per la nutrizione batterica. Questa capacità dell'ospite di sottrarre ferro ai batteri invasori costituisce una importante difesa dell'organismo contro le infezioni batteriche.

P. aeruginosa è rinomato per le sue grandi capacità di adattamento; quando questo batterio passa da un ambiente ricco ad un ambiente povero di ferro, percepisce questa variazione come un segnale dell'ingresso nell'ospite e reagisce producendo una serie di fattori che gli servono ad acquisire il ferro dalle risorse dell'ospite. Ad esempio, vengono prodotte tossine che facilitano il rilascio di ferro dalle cellule ed enzimi che distruggono le proteine leganti ferro dell'ospite. Inoltre, in risposta alla carenza di ferro, P. aeruginosa produce delle molecole chiamate siderofori (dal greco, trasportatori di ferro) capaci di sottrarre il ferro complessato alle proteine leganti ferro e di veicolarlo specificamente all'interno della cellula batterica. Il sideroforo più importante prodotto da P. aeruginosa è una molecola verde-fluorescente denominata pioverdina, ben visibile nelle colture di questo batterio.

Molti studi indicano come l'acquisizione di ferro mediata dalla pioverdina sia fondamentale per la formazione del biofilm nel polmone FC (Lamont et al., 2009).

Quando coltivato in laboratorio, P. aeruginosa forma efficientemente biofilm solo se la concentrazione di ferro libero varia in un intervallo definito (da 8 a 64 micromolare; Patriquin et al., 2008). Al di fuori di questo intervallo di concentrazione, il biofilm non si forma o si forma in modo difettoso e risulta pertanto sensibile all'azione degli antibiotici. Nel polmone FC la concentrazione di ferro libero può variare a seconda del soggetto, rimanendo tuttavia nei limiti che consentono la formazione del biofilm e l'instaurarsi dell'infezione cronica (Lamont et al., 2009).


I chelanti del ferro come farmaci anti-biofilm

I chelanti del ferro sono delle molecole in grado di legare il ferro libero oppure legato ad altre molecole. Alcuni chelanti non sono acquisibili da parte delle cellule, altri possono invece svolgere una funzione di trasportatori o sottrattori del ferro intracellulare, a seconda della loro biodisponibilità. Alcuni chelanti d'impiego clinico, come la desferriossamina B o Desferal® (DFO) sono di derivazione biologica e rappresentano dei siderofori, al pari della pioverdina per P. aeruginosa. Poiché, come accennato in precedenza, un eccesso di ferro libero è tossico per le cellule viventi, alcuni chelanti del ferro, come ad esempio il DFO, sono abitualmente usati come farmaci nella terapia di malattie da sovraccarico di ferro, facilitando l'eliminazione di tale metallo attraverso i reni.

Dato il ruolo del ferro nella genesi del biofilm, sono stati recentemente effettuati alcuni studi che hanno evidenziato l'efficacia di chelanti del ferro, di origine naturale o sintetica, nell'inibire la formazione del biofilm (O'May et al., 2009; Moreau-Marquis et al., 2009). In particolare si è visto come il DFO e il deferasirox siano in grado di inibire la genesi del biofilm di P. aeruginosa, se somministrati insieme all'antibiotico tobramicina (Moreau-Marquis et al., 2009). E' interessante notare come il DFO di per sé non ha effetto sul biofilm anzi, dato che P. aeruginosa è in grado di acquisire il ferro legato a DFO, promuove la formazione di biofilm in carenza di ferro o in ceppi incapaci di sintetizzare pioverdina, non rari tra le popolazioni di P. aeruginosa responsabili dell'infezione cronica (Banin et al., 2005, Banin et al., 2008; Visca et al., 2007). Questi dati suggeriscono che il meccanismo d'azione del DFO sul biofilm è plausibilmente indipendente dal sequestro del ferro e quindi si rendono necessari ulteriori studi per capire attraverso quale meccanismo l'associazione di tobramicina/DFO riduca la formazione del biofilm.

Altri studi hanno adottato una strategia opposta a quella sopra descritta, essendo finalizzati ad inibire il biofilm con un eccesso di ferro biodisponibile per P. aeruginosa. Questi studi hanno mostrato come alcuni chelanti pre-complessati con ferro oppure alte concentrazioni di ferro libero (50-200 micromolare) siano in grado di ridurre la formazione del biofilm in vitro (Musk and Hergenrother, 2008). Questi risultati, a nostro avviso, hanno una scarsa trasferibilità clinica a causa del potenziale tossico del ferro alle concentrazioni utilizzate.

Infine, sono stati recentemente pubblicati una serie di studi molto interessanti sull'effetto del DFO pre-complessato con il gallio. Il gallio è un metallo che a livello atomico assomiglia molto al ferro (ferromimetico). Così come P. aeruginosa può acquisire il ferro legato al DFO, esso può anche acquisire il gallio legato a tale chelante. La differenza è che il gallio non può sostituire il ferro come nutriente, anzi, ha un effetto negativo sul metabolismo batterico perché interferisce con i processi cellulari ferro-dipendenti. Si è visto che il complesso gallio-DFO in associazione con antibiotici aminoglicosidici ha un effetto negativo sulla formazione del biofilm in vitro. Inoltre, questa combinazione di farmaci aiuta a risolvere la cheratite nel coniglio, un tipo di infezione cronica caratterizzata dallo sviluppo di biofilm (Banin et al, 2008).

Sebbene le ricerche sopra descritte siano molto promettenti, esse sono state condotte prevalentemente in vitro. A nostro parere è necessario definire la reale efficacia delle combinazioni antibiotico-chelante in modelli animali d'infezione cronica e valutare approfonditamente rischi per il paziente derivanti dalla terapia chelante. Il principio di precauzione ci impone di considerare seriamente i numerosi effetti avversi legati all'impiego clinico di chelanti come il DFO, particolarmente nei pazienti CF che non presentano sovraccarico di ferro. L'uso di chelanti complessati con gallio presenta il rischio che il paziente si intossichi con un eccesso di questo elemento. Vi è poi la grande variabilità individuale nel microambiente del polmone FC legata al decorso clinico della malattia (concentrazione di lattoferrina, presenza di eme o ferro libero) che potrebbe seriamente condizionare l'efficacia locale dei chelanti. Peraltro, le concentrazioni di DFO raggiungibili localmente nel polmone FC non sono determinate. Inoltre, l'uso di chelanti pre-complessati con ferro aumenterebbe la disponibilità di ferro nel polmone e potrebbe facilitare l'instaurarsi di infezioni anche ad opera di batteri diversi da P. aeruginosa. Al riguardo non si può disconoscere il rischio infettivo associato all'uso continuato di DFO, ben documentato nei pazienti talassemici (Wanachiwanawin, 2000).

Quindi, le ricerche svolte fino ad oggi circa l'uso dei chelanti del ferro per curare l'infezione polmonare cronica da P. aeruginosa devono essere di stimolo per approfondimenti su questa complessa tematica, prima che si possa ravvisare una loro diretta applicazione nella pratica clinica.

Nei paragrafi che seguono cogliamo l'occasione per descrivere un altro processo importante nella patogenesi dell'infezione da P. aeruginosa, il "quorum sensing", e per riassumere le ricerche che il nostro gruppo sta conducendo su P. aeruginosa.

"Quorum sensing" e comportamento sociale dei batteri

Negli organismi pluricellulari, come l'uomo, gli animali e le piante, la comunicazione tra cellule è importante per concertare la risposta agli stimoli provenienti dall'ambiente esterno. Le singole cellule del nostro organismo comunicano tra loro grazie a segnali chimici ed elettrici. Anche le cellule batteriche possono comunicare tra loro. Il "quorum sensing" è un sistema che le cellule di P. aeruginosa usano per comunicare, utilizzando un linguaggio fatto di molecole, chiamate molecole segnale. Il "quorum sensing" serve a regolare la produzione di tossine, proteasi e di altri fattori di virulenza prodotti da P. aeruginosa. Inoltre il "quorum sensing" controlla la formazione del biofilm. Nell'espettorato dei pazienti cronicamente infettati da P. aeruginosa sono presenti le molecole segnale del "quorum sensing" e numerosi studi suggeriscono come questo processo svolga un ruolo importante nell'infezione cronica (Rasmussen and Givskow, 2006).

E' ormai chiaro che sostanze che inibiscono il "quorum sensing" hanno un effetto negativo sulla formazione del biofilm di P. aeruginosa, che risulta più suscettibile all'azione degli antibiotici (Rasmussen and Givskow, 2006). Ad esempio, il furanone C-30 inibisce il "quorum sensing" e la formazione del biofilm in vitro e, se somministrato a topi con infezione polmonare cronica, favorisce l'eliminazione dei batteri dal polmone (Hentzer et al., 2003). Purtroppo, questa molecola è tossica per l'uomo e non può essere usata in terapia. Anche l'estratto di aglio contiene delle sostanze con elevata azione anti-batterica e anti-biofilm. Alcune delle sostanze contenute nell'aglio, in via di caratterizzazione, esercitano una forte inibizione del "quorum sensing" e rendono il biofilm più suscettibile all'azione di antibiotici e del sistema immunitario dell'ospite (Bjarnsholt et al., 2005).

Sebbene la scoperta che il "quorum sensing" risalga a più di dieci anni fa, solo recentemente è aumentato l'interesse verso la ricerca di inibitori del "quorum sensing" da impiegare nello sviluppo di farmaci. Anche in questo tema, tuttavia , siamo ancora all'inizio di un lungo percorso che richiede ulteriori studi per meglio conoscere questo comportamento sociale dei batteri e per identificare molecole in grado di inibirlo.

Le ricerche su ferro, "quorum sensing" e virulenza di P. aeruginosa svolte presso l'Università di Roma Tre

Gli studi sopra decritti indicano che la risposta alla carenza di ferro ed il "quorum sensing" costituiscono degli ottimi bersagli per farmaci capaci di inibire la formazione del biofilm di P. aeruginosa. Oltre ad approfondire gli studi sulle molecole attive contro questi due processi biologici, è anche necessario identificare nuove molecole potenzialmente efficaci per combattere il biofilm al fine di facilitare il trattamento dell'infezione polmonare cronica.

Grazie ai finanziamenti che la FFC ha attribuito al nostro gruppo, stiamo conducendo due progetti di ricerca che hanno come fine ultimo l'identificazione di nuove molecole attive contro la risposta alla carenza di ferro ed il "quorum sensing". Per raggiungere tale scopo stiamo adottando due strategie diverse, tra loro complementari. La prima consiste nell'identificare nuovi fattori molecolari coinvolti in questi due fenomeni, in quanto potrebbero costituire bersagli terapeutici (progetto FFC #10/2007); la seconda consiste nel mettere a punto dei sistemi di screening innovativi che possano identificare molecole completamente nuove rispetto a quelle identificate fino ad oggi (progetto FFC #8/2008).

Di seguito, riportiamo una sintesi degli studi che stiamo conducendo, relativamente ai progetti FFC sopra citati.

1 - Importanza del quorum sensing e dell'acquisizione di ferro nella virulenza di Pseudomonas aeruginosa: identificazione e caratterizzazione di bersagli terapeutici. (Progetto FFC #10/2007). Abbiamo identificato e caratterizzato la proteina CysB, un nuovo fattore che controlla positivamente la produzione di sistemi di acquisizione del ferro e, probabilmente, di altri fattori di virulenza. Inoltre, abbiamo identificato circa 200 proteine presenti nel periplasma (una struttura sub-cellulare fondamentale per la vita di P. aeruginosa), tra cui alcuni fattori potenzialmente coinvolti nell'acquisizione del ferro (Imperi et al, 2009). Sono anche state identificate e caratterizzate le proteine responsabili dell'esporto della pioverdina all'esterno della cellula di P. aeruginosa. Abbiamo dimostrato che, se si inattiva questo sistema di esporto, la pioverdina si accumula nella cellula batterica e ne riduce fortemente la vitalità.

Per quanto riguarda il "quorum sensing", abbiamo studiato in modo approfondito la proteina RsaL, un regolatore negativo di questo sistema di comunicazione tra batteri. RsaL da un lato mantiene bassa la produzione di fattori di virulenza, in modo da non stimolare il sistema immunitario dell'ospite, dall'altro stimola la formazione del biofilm. Quindi RsaL potrebbe svolgere un ruolo importante nell'infezione cronica, caratterizzata appunto da formazione di biofilm e limitata produzione di fattori di virulenza (Rampioni et al., 2007). Attualmente stiamo studiando la relazione esistente tra risposta alla carenza di ferro e "quorum sensing", al fine di identificare un fattore comune, coinvolto in entrambi i processi.

In conclusione, le ricerche svolte in questo progetto, che si concluderà tra pochi mesi, hanno portato all'identificazione e alla caratterizzazione di fattori coinvolti in due processi fondamentali per la patogenesi di P. aeruginosa nella FC: la risposta alla carenza di ferro ed il "quorum sensing", ampliando le basi per lo sviluppo di terapie innovative anti-P. aeruginosa.

2 - Sviluppo e validazione di un nuovo sistema di screening per l'identificazione di molecole in grado di inibire la virulenza di Pseudomonas aeruginosa (Progetto FFC #8/2008). Le industrie farmaceutiche ed i laboratori di ricerca hanno a disposizione collezioni di milioni di molecole naturali e sintetiche che potrebbero avere un attività contro la risposta alla carenza di ferro ed il "quorum sensing". Tuttavia, i metodi ad oggi disponibili per valutare l'effetto di molecole potenzialmente attive su questi due processi sono lenti, laboriosi e costosi. Sono dunque necessari dei metodi nuovi per analizzare rapidamente, possibilmente mediante sistemi robotizzati e automatizzati, migliaia di molecole. Per risolvere questo problema stiamo lavorando per modificare geneticamente P. aeruginosa convertendolo in una sorta di sensore biologico. I batteri geneticamente modificati emettono un segnale (nello specifico fluorescenza) solo se i processi della risposta alla carenza di ferro ed il "quorum se nsing" sono in essi funzionanti. L'emissione di fluorescenza è un fenomeno facilmente misurabile con strumenti opportuni. Pertanto, se i batteri geneticamente modificati verranno coltivati in presenza di molecole potenzialmente attive contro la risposta alla carenza di ferro e/o il "quorum sensing", gli effetti saranno facilmente individuabili perché si misurerà, nella provetta contenente il principio attivo, una diminuzione nella emissione di fluorescenza rispetto alla provetta di controllo in cui non è stato aggiunto nessun composto. I batteri ricombinanti costruiti in questo progetto potranno essere usati per saggiare sostanze naturali e sintetiche, fornendo alla comunità scientifica un valido strumento per la scoperta di nuovi farmaci anti-P. aeruginosa.

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