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Recensione di pubblicazione da progetto FFC

7 novembre 2017

Cellule epiteliali delle vie aeree da brushing nasale: un modello ex vivo per diagnosi e valutazione di nuovi farmaci per FC

Nicoletta Pedemonte U.O.C. Genetica Medica Istituto Giannina Gaslini, Genova

Lo studio delle cellule epiteliali derivate da brushing nasale può fornire un importante contributo alla diagnosi di FC e ad una discreta previsione della gravità della malattia, formulata in base al grado di attività della proteina CFTR.

La fibrosi cistica (FC) è causata da mutazioni in un gene che codifica per una proteina, localizzata sulla membrana delle cellule, chiamata CFTR, che funziona come canale del cloruro, cioè permette il passaggio di ioni cloruro da un lato all’altro della membrana cellulare. La mutazione più comune fra i pazienti con fibrosi cistica causa la produzione di una proteina CFTR in cui manca un aminoacido, la fenilalanina in posizione 508 (F508del-CFTR). Quando è prodotta, la proteina mutata non riesce a ripiegarsi normalmente, e viene indirizzata alla degradazione. Oltre alla F508del, sono state descritte altre 2000 mutazioni circa, ma solo poche di esse sono state studiate per capire che tipo di difetto causino a livello della proteina CFTR. Questi studi richiedono complesse procedure in vitro. Infatti, bisogna generare per ogni mutazione quello che viene definito “costrutto”, cioè una sorta di gene CFTR artificiale, in cui viene inserita la mutazione che si vuole studiare. Bisogna poi introdurre questo gene CFTR artificiale mutato dentro a cellule “vuote” cioè senza CFTR, in modo da ottenere una linea cellulare che esprima solo la proteina mutata di interesse. Tutte queste procedure, che sono preliminari allo studio vero e proprio della mutazione, richiedono tempi stimabili dai 3 ai 6 mesi (ma si può arrivare anche a 12 mesi, a seconda della mutazione che si vuole studiare). La disponibilità di cellule dell’epitelio delle vie aeree di pazienti con fibrosi cistica (che esprimono naturalmente la CFTR mutata) permette di abbreviare notevolmente i tempi. Oltre allo studio dell’effetto di una mutazione sulla proteina CFTR, queste cellule possono essere anche utilizzate per identificare quali farmaci (fra quelli già disponibili in commercio e quelli in corso di sviluppo clinico o preclinico) siano efficaci nel recuperare il difetto di quel particolare mutante. Naturalmente, maggiore è il numero di cellule disponibili e maggiore sarà il numero degli studi che potranno essere condotti.

La maggioranza delle cellule di epitelio delle vie aeree disponibili per la ricerca deriva dai pazienti sottoposti a trapianto di polmoni. Infatti, dai polmoni del paziente espiantati, seguendo dei rigorosi protocolli, è possibile recuperare delle cellule che mantengono la possibilità di crescere (seppur per pochi passaggi) e di differenziare poi in un epitelio bronchiale simile a quello presente nelle vie aeree. Considerando che i pazienti che si sottopongono a trapianto sono principalmente quelli con mutazioni severe e che, a eccezione della F508del, la frequenza delle altre mutazioni è molto più bassa, solo una piccola frazione delle mutazioni descritte in letteratura può essere studiata utilizzando le cellule dei pazienti FC sottoposti a trapianto (Colture primarie).

Un’altra fonte di cellule epiteliali delle vie aeree sono le cavità nasali. Esiste una tecnica, chiamata brushing (dall’inglese to brush, spazzolare) mediante la quale è possibile recuperare cellule epiteliali strofinando l’interno superiore delle cavità nasali con un apposito spazzolino. Tale tecnica (non invasiva) consente di collezionare cellule da ogni paziente FC (a partire dai 2 anni di età). Il numero di cellule che possono essere ottenute così però è molto esiguo. L’ottimizzazione delle metodiche di coltura permette di espandere il numero di cellule ottenute preservando le loro caratteristiche e rendendo quindi possibili studi prima d’ora non fattibili. In particolare, un gruppo di ricercatori dell’Università di Napoli Federico II, del CEINGE di Napoli, dell’Università di Novara e dell’Ospedale San Raffaele di Milano sta lavorando attivamente per migliorare sempre più le tecniche di prelievo e coltura delle cellule, e per sviluppare nuovi saggi che permettano di utilizzare al meglio questa importante fonte di campioni biologici. Nell’articolo qui sotto citato (1), derivato da un progetto finanziato dalla Fondazione Ricerca FC (2), gli autori, affiliati agli istituti più sopra citati, hanno eseguito 50 brushing da pazienti FC e controlli, ottenendo in 45 casi una coltura positiva, un risultato notevole, che dimostra quanto padroneggino la tecnica. Inoltre, utilizzando tali campioni, questi ricercatori sono riusciti a ottenere dei dati molto interessanti. In primo luogo, valutando l’espressione di CFTR nei pazienti e nei controlli hanno dimostrato che, sia negli uni che negli altri, l’espressione è ampiamente variabile, confermando quanto fino a ora solo supposto. In particolare è importante la dimostrazione che nei pazienti la variabilità dell’espressione di CFTR si riscontra anche nell’ambito di una stessa mutazione. Inoltre, hanno dimostrato che è possibile aumentare l’espressione di CFTR agendo farmacologicamente (usando come farmaco un composto, il sodio butirrato, noto da tempo in laboratorio per questa sua azione). In secondo luogo, studiando una mutazione su CFTR non ancora caratterizzata, hanno dimostrato che essa agisce causando un difetto definito di splicing (quel difetto che interviene alterando la lettura della corretta sequenza del gene).

Infine, i ricercatori hanno utilizzato un saggio funzionale che misura l’attività delle diverse proteine mutate espresse dalle cellule dei pazienti al fine di determinarne la risposta a stimoli fisiologici. Questo ha permesso ai ricercatori di stabilire che pazienti FC con due mutazioni definite gravi mostravano un’attività di CFTR inferiore al 10% (considerando 100% l’attività di CFTR riscontrata in soggetti volontari non malati né portatori FC sottoposti a brushing per fungere da controlli) . Inoltre, soggetti FC con una mutazione grave e una lieve mostravano un’attività di CFTR tra 10 e 30%, mentre i portatori sani, cioè con una sola copia della mutazione, mostravano un’attività tra 40 e 70% di quella normale.

Il lavoro di questi autori dimostra chiaramente che lo studio delle cellule epiteliali derivate da brushing nasale può fornire un importante contributo alla diagnosi di FC e a una discreta previsione della gravità della malattia, formulata in base al grado di attività della proteina CFTR. Un tale approccio laboratoristico potrebbe essere di particolare rilevanza per quei pazienti per i quali il test del sudore ha dato risultati ambigui (borderline o negativi), contribuendo a distinguere lo stato di portatore sano da quello di affetto da FC. Gli stessi autori aggiungono che il loro studio indica che i livelli di attività di CFTR sono molto eterogenei sia nei soggetti sani sia nei malati FC e quindi sarebbe necessario indagare un numero più ampio di individui sani per avere robusti valori di riferimento.

1. Di Lullo AM, Scorza M, Amato F, Comegna M, Raia V, Maiuri L, Ilardi G, Cantone E, Castaldo G, Iengo M. An “ex vivo model” contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2017 Jun;37(3):207-213. doi: 10.14639/0392-100X-1328.
2. Nota. Questa pubblicazione è derivata da un progetto finanziato dalla Fondazione Ricerca FC (Progetto FFC 7/2013), con il supporto di adozione della Delegazione FFC di Latina.