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Recensione di pubblicazione da progetto FFC

6 febbraio 2019

Nuovo metodo per migliorare la diagnosi di infezione da Pseudomonas aeruginosa

F. Malvezzi

Il batterio Pseudomonas aeruginosa (Pa) tende a insediarsi cronicamente nel polmone FC ed è difficile da eradicare, anche nelle fasi iniziali dell’infezione, a causa di resistenza agli antibiotici e persistenza. In particolare, la persistenza è uno stato di sonnolenza che i batteri possono adottare e poi interrompere, riattivandosi per provocare recidive e cronicizzare l’infezione. I batteri persistenti spesso non sono diagnosticabili perché non crescono nei terreni di coltura abitualmente usati in microbiologia e utilizzati nella diagnosi: sono vitali ma non coltivabili (indicati con la sigla VBNC). Il progetto FFC #13/2017, coordinato da Francesca Biavasco dell’Università Politecnica delle Marche, si inserisce in questo contesto, con l’obiettivo di indagare le cause della persistenza batterica e migliorare la diagnosi dell’infezione da Pa, mediante identificazione dei batteri VBNC con nuove tecniche sperimentali.

Recentemente, i ricercatori coinvolti nel progetto hanno pubblicato un lavoro (1) in cui riportano i risultati ottenuti utilizzando un’estensione di una nota tecnica diagnostica, la PCR. La sigla PCR sta per polymerase chain reaction (reazione a catena della polimerasi), metodologia utilizzata per ottenere quantità che ammontano a un milionesimo di grammo di copie di segmenti specifici di DNA o di RNA, partendo da quantità minime (anche una sola molecola) presenti in una preparazione di acidi nucleici, provenienti dal campione batterico in esame.

Per raggiungere lo scopo e riuscire a portare alla luce anche le forme persistenti del batterio Pa, gli autori dell’articolo (1) descrivono l’utilizzo di una tecnica strettamente imparentata con la PCR, individuata dalla sigla qPCR, attraverso un protocollo che prevede di individuare un gene specifico, indicato con la sigla ecfX, che funge da marcatore della presenza di Pseudomonas, in qualsiasi stato vitale il batterio si trovi. Il protocollo è stato inizialmente validato dagli autori del lavoro, verificando che la sequenza target ecfX è specifica per Pseudomonas aeruginosa e non individua altre specie batteriche. Questo approccio evita l’utilizzo del terreno di coltura (quello usato abitualmente per identificare i batteri presenti in un campione biologico e studiarne la sensibilità agli antibiotici [antibiogranmma]), dove i batteri VBNC dormienti non crescono. I ricercatori si sono avvalsi di un numero totale di 88 campioni di escreato provenienti da pazienti FC, 47 negativi nella coltura standard e quindi teoricamente privi del batterio. I campioni sono stati analizzati riguardo alla presenza di forme VBNC, confrontando le conte batteriche ottenute mediante l’esame colturale standard e il protocollo non-colturale (qPCR), basato sul rilevamento del DNA specie-specifico per ecfX. I risultati hanno evidenziato una discrepanza tra il numero di cellule batteriche totali e quello delle cellule coltivabili. In particolare 9 su 47 campioni negativi nella coltura standard, sono invece risultati positivi attraverso la qPCR, e 10 su 41 campioni che erano già positivi con la coltura hanno mostrato una maggiore conta batterica quando analizzati in qPCR. Questi risultati indicano l’affidabilità della tecnica usata, suggerendo quindi la presenza di vere e proprie forme VBNC.

Gli autori concludono che, in confronto a metodi di coltura normalmente usati, la procedura descritta in questo lavoro permette una rilevazione del patogeno Pa non solo in modo più veloce (si risparmiano i lunghi tempi per far crescere i batteri in coltura), ma anche più affidabile (identifica anche i batteri dormienti). Aggiungendo le nostre riflessioni, sottolineiamo che questo non significa che si possa far rientrare il nuovo protocollo qPCR nella pratica diagnostica dall’oggi al domani, ma pensiamo che la nuova tecnica potrebbe offrire un supporto a quelle diagnostiche tradizionali. C’è anche da indagare meglio in che misura la tecnica qPCR possa eventualmente fornire dati falsamente positivi, agli effetti delle decisioni terapeutiche. Ma senza dubbio questi studi permettono di capire di più sulla persistenza batterica di Pa e sul perché gli antibiotici tradizionalmente usati a volte falliscano la loro missione, e si verifichino esacerbazioni infettive in successione nonostante il trattamento. Potrebbero essere gli antibiotici stessi a mettere a dormire il patogeno, in forme VBNC, pronte peraltro a riattivarsi al momento opportuno? Futuri studi potranno chiarire se e come gli antibiotici normalmente usati possano intervenire nella formazione di VBNC.

Progetto FFC#13 2017 coordinato da Francesca Biavasco (Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università Politecnica delle Marche) con il contributo di LIFC Toscana Onlus.

Routine culture-based diagnosis of Pseudomonas aeruginosa lung infection in Cystic Fibrosis (CF) patients can be hampered by the phenotypic variability of the microorganism, including its transition to a Viable But Non-Culturable (VBNC) state. The aim of this study (1), supported by FFC #13/2017 grant, was to validate an ecfX-targeting qPCR protocol developed to detect all viable P. aeruginosa bacteria and to identify VBNC forms in CF sputum samples.
The study involved 88 CF sputum samples, 41 Culture-Positive (CP) and 47 Culture-Negative (CN). Total DNA from sputum samples was extracted by a commercial kit, whereas a crude extract was obtained from the broth cultures. Extracellular DNA (eDNA) interference was evaluated by comparing the qPCR counts obtained from DNase-treated and untreated aliquots of the same samples. The statistical significance of the results was assessed by the Wilcoxon test and Student’s t-test.
The newly-developed qPCR protocol identified 96.6% of the P. aeruginosa isolates; no amplification was obtained with strains belonging to different species. Moreover, qPCR detected P. aeruginosa in 9/47 CN samples and showed higher bacterial counts compared with the culture method in 10/41 CP samples.
These findings demonstrate the reliability of the newly-developed qPCR protocol and further highlight the need for harnessing a non-culture approach to achieve an accurate microbiological diagnosis of P. aeruginosa CF lung infection and a greater understanding of its evolution.

1) Mangiaterra G, Amiri M, Di Cesare A, Pasquaroli S, Manso E, Cirilli N, Citterio B, Vignaroli C, Biavasco F. Detection of viable but non-culturable Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis by qPCR: a validation study. BMC Infect Dis. 2018 Dec 27;18(1):701. doi: 10.1186/s12879-018-3612-9.