Anna Cereseto
Lo sviluppo di nuove tecnologie per la terapia genica ha aperto nuove prospettive nella ricerca di una cura per le malattie genetiche come la fibrosi cistica. In particolare, la tecnica basata sulla nucleasi CRISPR-Cas9 offre la possibilità di correggere (editing) il DNA genomico con elevata efficienza e precisione.
In questo progetto i ricercatori si propongono di ripristinare il corretto funzionamento del gene CFTR con mutazione F508del, la più frequente in fibrosi cistica, introducendo nella sua sequenza piccole mutazioni che dovrebbero neutralizzare l’effetto della mutazione originale causante malattia.
Per identificare queste nuove mutazioni sfrutteranno un circuito molecolare, chiamato EvolvR e basato sulla tecnica CRISPR-Cas9, nella versione CRIS-base editor, che consentirà di inserire nuove mutazioni nella sequenza del gene CFTR. Queste mutazioni saranno create modificando in modo mirato singole basi del DNA, e fra di loro saranno selezionate unicamente quelle che promuovono il corretto trasporto in membrana della proteina CFTR e che agiscono quindi come mutazioni neutralizzanti. Un avanzato screening funzionale rivelerà infine le mutazioni neutralizzanti migliori, in grado di ripristinare l’attività della proteina. Queste mutazioni saranno infine riprodotte in modelli cellulari di fibrosi cistica F508del (cellule epiteliali delle vie aeree e organoidi intestinali derivati da pazienti). La prospettiva è che il gene così manipolato, pur conservando la mutazione originaria F508del, produca, per effetto delle nuove mutazioni, una proteina CFTR capace di corretto funzionamento.
CRISPR-Cas9 nuclease offers the opportunity to edit the genomic DNA with high efficiency and precision. The most common mutation causing Cystic Fibrosis is the deletion of a phenylalanine in position 508 of the CFTR protein (F508del) and the current available technologies are not efficient for the correction of this type of mutations (3 nucleotides deletion). Here, researchers propose to restore the activity of the F508del CFTR by the development of a new strategy which rely on the existence of neutralizing mutations. Indeed, previous reports showed that folding and trafficking defects caused by F508del CFTR can be partially corrected by secondary point mutations in the CFTR gene (neutralizing mutations). In order to identify new mutations able to restore F508del CFTR channel activity, researchers will exploit a molecular circuit, called EvolvR and based on CRISPR-Cas9, to insert new random mutations into the CFTR sequence and to specifically select those able to promote the correct trafficking of the protein to the plasma membrane. A functional screening will be performed to isolate the mutations that best restore the activity of CFTR channel. Selected mutations will be inserted into cellular models for cystic fibrosis carrying the F508del mutation (primary airway epithelial cells and patients’ intestinal organoids) by mean of CRISPR-base editor, that allow targeted single-base DNA modifications.
