Un avanzamento del metodo CRISPR/Cas9 permette di cambiare una singola lettera del codice genetico e correggere il segnale di stop.

CRISPR/cas9 è l’ultima scoperta dell’ingegneria genetica: un sistema derivato dai batteri che, introdotto da un vettore all’interno della cellula e indirizzato da un RNA guida, riconosce il tratto di DNA con sequenza mutata e lo sostituisce con sequenza normale. CRISPR/Cas9 viene continuamente perfezionato in laboratorio per renderlo adatto a correzioni sempre più fini. In questo lavoro, un gruppo di ricercatori olandesi mostra come una versione avanzata di CRISPR/Cas9 sia in grado di correggere una singola base del DNA, l’Adenina. Infatti il sistema è chiamato “CRISPR basato sulla correzione dell’Adenina” (CRISPR-Based Adenine Editors). Ricorrendo a un linguaggio preso dal mondo della scrittura, invece di correggere tagliando via l’intera parola costituita da una sequenza più o meno lunga di lettere del DNA, corregge la singola lettera che rende sbagliata quella parola.

Questo fatto riveste grande importanza nel campo della correzione delle mutazioni stop: queste mutazioni interrompono la sintesi della proteina perché a un certo punto la sequenza del DNA del gene contiene un segnale di stop. In tutto l’alfabeto genetico i codici di stop sono sempre gli stessi e con stessa sequenza fissa di cosiddette basi o nucleotidi: UAG, UAA, UGA. Cambiando la A della base adenina con un’altra base (es: G di Guanina) la tripletta invece che UAG diventa UGG, il messaggio di stop viene annullato e la sintesi della proteina può riprendere.

I ricercatori (1) hanno applicato questo sistema su 3 organoidi intestinali e 1 organoide derivato da cellule epiteliali nasali, prelevati dalla biobanca esistente presso l’Università di Utrecht. Le mutazioni stop presenti in questi organoidi erano R785X (allo stato omozigote), W1282X (omozigote), R553X e R1162X (queste due ultime accompagnate da F508del come seconda mutazione). Dopo l’applicazione del nuovo CRISPR gli autori dimostrano con varie prove che è avvenuta la sintesi completa della proteina CFTR, che funziona: gli organoidi intestinali (sferule microscopiche) non rimangono chiusi e piccoli (come quando non c’è CFTR o questa non funziona), ma si rigonfiano grazie al trasporto, al loro interno, di ione cloro e acqua da parte della proteina funzionante.

Il netto vantaggio del nuovo metodo è proprio nella precisione: colpendo una singola lettera che viene strettamente individuata all’interno della sequenza del gene, ci sono meno rischi (anzi nel lavoro non ne viene riportato nessuno) di effetti off-target (fuori dell’obiettivo), vale a dire variazioni indesiderate in altri punti del genoma, che rappresenterebbero il rischio maggiore della correzione più grossolana realizzata dal CRISPR/Cas9 di partenza. Lo svantaggio è che l’efficienza non è molto elevata, in quanto con un trattamento si correggono circa il 9% delle cellule trattate. Gli autori dicono che è sufficiente un 10% di funzionamento di CFTR (come è nel caso delle mutazioni con funzione residua), perché i sintomi della malattia siano più modesti. Dicono anche che si può ovviare all’inconveniente applicando multipli trattamenti consecutivi, possibili data la mancanza di effetti off target (da confermare, n.d.r).
Sempre secondo gli autori, uno studio teorico della lista delle 412 mutazioni presenti nel database CFTR2.org permette di dire che non solo le mutazioni stop, ma quasi il 40% di tutte le mutazioni presenta caratteristiche molecolari trattabili con il nuovo metodo basato sulla correzione di una singola base. Come detto molte volte, il progresso nel campo del gene editing viaggia a notevole velocità, ma per vederne le applicazioni cliniche crediamo ci sia ancora parecchia strada da percorrere.

1) Geurts MH, de Poel E, Amatngalim GD, Beekman JM, Clevers H. “CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank” Cell Stem Cell. 2020 Apr 2;26(4):503-510.e7. doi: 10.1016/j.stem.2020.01.019. Epub 2020 Feb 20.