Il sequenziamento di un gene è quella tecnica che permette di leggere la sequenza delle basi che compongono il DNA genico. Le basi vengono riconosciute e ricopiate in frammenti di diversa lunghezza: il procedimento avviene “in successione”, base dopo base, lungo e costoso. Con il Sequenziamento di Ultima Generazione (Next Generation Sequencing, NGS), il procedimento viene invece eseguito “in parallelo”, realizzando il riconoscimento contemporaneo di un numero enorme di basi, cosa che consente un notevole risparmio di tempo.
La tecnica NGS si può applicare anche per riconoscere, all’interno della sequenza complessiva del gene, particolari frammenti con sequenza alterata rispetto al normale (mutazioni). Un gruppo di esperti genetisti italiani ha sviluppato un nuovo test genetico allestendo un pannello di 188 mutazioni del gene CFTR da diagnosticare attraverso tecnica NGS (1). Il nuovo test, una volta allestito, è stato validato su due tipi di materiali: su campioni di sangue periferico oppure su gocce di sangue essiccato, entrambi naturalmente contenenti il DNA da indagare. Le gocce (in totale oltre 1400 campioni) rappresentavano il materiale raccolto presso l’ospedale milanese che è di riferimento per lo screening neonatale FC della regione Lombardia. I prelievi erano stati eseguiti in popolazione non FC sottoposta a test per il portatore, ma soprattutto in soggetti con diagnosi di FC confermata per altre vie e afferenti ai centri regionali FC di Milano e di Roma (in totale oltre 1100 campioni, oltre 600 di pazienti del Nord Italia e circa 500 del Centro Italia).
Per la validazione del nuovo test, la ricerca delle mutazioni CFTR sul materiale raccolto è stata realizzata in duplice modo: attraverso il nuovo metodo e attraverso altro test correntemente usato. In questo modo si è visto il 100% di concordanza fra i risultati offerti dal nuovo e vecchio test. Non sono sfuggite quindi al nuovo test mutazioni diagnosticate con altri metodi (quindi non ci sono stati falsi negativi), né il nuovo test ha diagnosticato presenza di mutazioni non confermate con altri metodi (no falsi positivi).
Segnaliamo i motivi per cui il nuovo test, chiamato 188-CF-NGS, ci sembra di particolare interesse.
Intanto i vantaggi offerti dalla nuova tecnica NGS: il sequenziamento viene automatizzato, l’accuratezza dell’esame è operatore-indipendente, il risparmio di tempo (e quindi si spera anche di costi complessivi del test) è notevole. Poi il razionale alla base della scelta delle mutazioni che costituiscono il pannello: sono comprese le mutazioni più frequenti in Italia, ma anche altre meno frequenti o frequenti in alcune regioni (ad esempio la T388I, mutazione molto diffusa nella popolazione sarda). Quindi il pannello in questione appare più adatto per essere usato su scala nazionale rispetto ad altri esistenti. Il numero elevato di mutazioni comprese ottiene che, sia nei pazienti del Nord sia in quelli del Centro Italia, il test sia in grado di identificare il 95% delle mutazioni del loro genotipo. Questo significa che il test è in grado di diagnosticare il 95% dei portatori sani di FC presenti nella popolazione di quelle regioni. È un tasso di riconoscimento di portatori (detection rate) molto elevato, nettamente superiore a quello fornito da altri test oggi disponibili. Ultimo vantaggio, il fatto che il test comprende anche le mutazioni chiamate “da riarrangiamento genomico” (grandi delezioni/inserzioni di frammenti di DNA nel gene CFTR). La ricerca di queste particolari mutazioni oggi avviene attraverso un’indagine apposita, che viene eseguita come ultimo livello degli accertamenti genetici per FC se i precedenti livelli non hanno dato risultato, mentre invece è utile poterla eseguire in contemporanea alle altre.
In sostanza il nuovo test 188-CF-NGS potrebbe essere rivolto a un impiego su larga scala: nella ricerca delle mutazioni CFTR per conoscere il genotipo del malato FC, per lo screening neonatale e per lo screening del portatore, perché il risultato che fornisce è più accurato e i tempi di risposta sono più brevi. Per problemi diagnostici particolari rimangono invece più indicate le tecniche di approfondimento già in uso; rispetto a queste è utile sapere che basta semplicemente togliere i filtri informatici che vincolano la lettura delle sole 188 mutazioni, e, senza ripetere l’esperimento, si ottiene in tempo reale il sequenziamento per esteso di tutto il gene CFTR, senza tempi e costi aggiuntivi.
1) Lucarelli M, Porcaro L, Biffignandi A, Costantino L, Giannone V, Alberti L, Bruno SM, Corbetta C, Torresani E, Colombo C, Seia M. “A New Targeted CFTR Mutation Panel Based on Next-Generation Sequencing Technology”. J Mol Diagn. 2017 Sep;19(5):788-800. doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.06.002. Epub 2017 Jul 20.