All’interno del progetto Task Force for Cystic Fibrosis è stato scoperto ARN23765, un correttore di CFTR con un’elevata potenza nel recuperare la funzione della proteina mutata in cellule epiteliali bronchiali da persone con fibrosi cistica (FC) omozigoti per la mutazione F508del (cioè portatori della mutazione su entrambe le copie del gene). Per meglio caratterizzare ARN23765 e rafforzarne il profilo come candidato allo sviluppo preclinico per il trattamento della FC, il gruppo di ricerca si è proposto di identificare a livello molecolare il suo meccanismo d’azione e il sito di interazione con il suo target biologico.
Il meccanismo d’azione di ARN23765 è stato studiato in cellule integre attraverso l’approccio biochimico di Photo-Affinity Labeling (PAL), precedentemente usato nel progetto FFC#4/2020 e in grado di mostrare, nelle cellule viventi, l’interazione tra ARN23765 e il canale CFTR. Per identificare le regioni della proteina CFTR coinvolte nell’azione di ARN23765 sono stati effettuati studi computazionali e funzionali, insieme a esperimenti di mutagenesi, che consistono nell’inserire mutazioni in siti specifici del DNA di CFTR per evidenziare le sequenze essenziali alla correzione indotta da ARN23765.
Il meccanismo d’azione di ARN23765 in cellule integre è stato identificato attraverso studi di PAL usando sonde chimiche strutturalmente correlate al correttore. Inoltre, sono stati condotti studi funzionali con specifici domini di CFTR per permettere di identificare le porzioni proteiche coinvolte nella correzione indotta da ARN23765. Infatti, la proteina CFTR è composta da 5 domini: 3 nel citoplasma (NBD1, NBD2 e R domain) e due che attraversano la membrana apicale (MDS1 e MSD2). Infine, sono stati effettuate analisi computazionali insieme a esperimenti di mutagenesi per chiarire le basi molecolari dell’interazione di ARN23765 con il suo target biologico.
L’interazione di ARN23765 con CFTR è stata studiata in cellule FC con mutazione F508del-CFTR. Gli studi funzionali con i diversi domini di CFTR hanno dimostrato che l’interazione con ARN23765 coinvolge la porzione proteica tra MSD1-NBD1. Sono stati identificati i residui amminoacidici coinvolti nell’interazione tra ARN23765 e CFTR.
I risultati di questo progetto contribuiscono a chiarire le basi molecolari del recupero dell’attività di CFTR indotta da ARN23765. I dati mostrano che in cellule integre il correttore si lega direttamente a CFTR, stabilizzandola attraverso interazioni specifiche con residui amminoacidici in una regione proteica definita.