Lo studio si proponeva di aumentare la quantità di proteina CFTR presente nella cellula, anche se mutata, con lo scopo di compensare la diminuita funzionalità con l’aumento di quantità. Per fare ciò si è pensato di agire su due aspetti dell’espressione di un gene (DNA): 1) sul promotore del gene, che è la sequenza di DNA riconosciuta da gruppi di proteine che controllano quante copie del gene CFTR devono essere prodotte (cioè trascritte in mRNA); 2) su sequenze specifiche dell’mRNA di CFTR, bersaglio di piccoli RNA (microRNA) che portano di solito a una minor produzione della proteina.
Sul punto 1, i ricercatori hanno costruito un particolare plasmide, cioè una piccola molecola aggiuntiva di DNA capace di conferire alla cellula particolari caratteristiche. In questo caso il plasmide è stato pensato per produrre un complesso di proteine e molecole di RNA capaci di legarsi al promotore di CFTR e attivare la sua trascrizione, aumentando così le copie di RNA prodotte e di conseguenza di proteina finale. Questo complesso proteine-RNA è costituito principalmente da una proteina Cas9 modificata in modo che sia incapace di tagliare il DNA e fusa a una proteina che attiva la trascrizione dei geni; e un RNA guida per posizionare Cas9 sul promotore di CFTR.
Per quanto riguarda il punto 2, sono state usate delle molecole artificiali (PNA – Peptide Nucleic Acid) simili al DNA ma modificate nella sequenza per specifici aminoacidi che le rendono particolarmente stabili. Lo scopo di queste molecole era contrastare l’azione dei microRNA, stabilizzando in qualche modo l’RNA di CFTR ed evitando la sua degradazione.
Sebbene da punti di vista diversi, questi due approcci hanno permesso di aumentare la quantità di espressione del gene CFTR, aprendo la strada allo sviluppo di molecole capaci di rendere maggiormente disponibile la proteina CFTR, anche mutata, all’azione degli attuali farmaci modulatori, migliorandone l’effetto clinico.
Un ulteriore importante risultato è stato quello di aver messo a punto un sistema di trasporto dei PNA all’interno delle cellule nasali. Il sistema è basato sull’uso di nanoparticelle di PLGA (acido poli lattico-co-glicolico), capaci di veicolare piccole molecole anche in forma aerosol e già in uso clinico.
In this project the researchers sought to use an alternative or adjuvant approach to the use of existing modulators, potentiators and correctors, or combinations thereof. The rationale of the project was to increase the amount of CFTR protein, even if mutated, with the aim of compensating for the decreased functionality with the increase in amount. To do this we decided to act on two aspects of gene expression: 1) on the gene promoter, DNA sequence recognized by protein complexes that control how many copies of the CFTR gene must be made (transcribed into mRNA); 2) on specific sequences of CFTR mRNA targeted by small RNAs (microRNAs) which usually cause a decrease in protein production.
On point 1, we built a plasmid construct capable, once delivered inside the cells, of producing a complex of proteins and RNA molecules to recognize the CFTR promoter, activating its transcription and increasing the mRNA copies. This complex consists of a modified CAS9 protein, unable to cut DNA but fused to a trans-activator factor. This protein is expressed in cells together with a guide RNA to recognize the CFTR promoter, specifically activating and/or increasing its transcription and therefore the amount of final CFTR protein.
As regards point 2, we used artificial molecules (PNA – Peptide Nucleic Acid), similar to DNA molecules, but modified by replacing the sugar-phosphate backbone with amino acids, which make them particularly stable. The purpose of these molecules was to counteract the action of the microRNAs, therefore, to stabilize the CFTR mRNA, avoiding its degradation. Therefore, although from different points of view, these two approaches have made it possible to increase the amount of expression of the CFTR gene, paving the way for the development of molecules capable of increasing the amount of the CFTR protein, which although mutated, would serve as a substrate for the current modulators to improve their clinical effect.
A further important result was to develop a delivery system for these molecules, capable of working also for other types of molecules, based on the use of PLGA (poly lactic glycolic acid) nanoparticles, vectors capable of transporting small molecules even in aerosol form and already in clinical use.
Abstract presentati a congressi scientifici
