Successo di esperimenti in vitro con tecnica molecolare ad alta precisione.

Il gruppo di ricerca coordinato da Franco Pagani, del Centro Internazionale di Ingegneria Genetica e Biotecnologie (ICGEB) di Trieste, continua gli studi iniziati alcuni anni fa su di un gruppo di mutazioni chiamate splicing. Esse rappresentano circa il 10-12% di tutte le mutazioni del gene CFTR, non hanno ancora un farmaco specifico disponibile, comportano gravità variabile di sintomi perché possono appartenere sia alla classe funzionale 1 (severe) che 5 (benigne).

Lo splicing è quel processo per cui dall’intera sequenza di un gene si passa, attraverso il riassemblaggio di alcuni suoi frammenti (gli esoni) e l’eliminazione di altri (gli introni), a una sequenza molto più breve: RNA messaggero o mRNA. È questo il responsabile della trasmissione del messaggio del gene per la sintesi della proteina CFTR: se mRNA è normale, sarà prodotta CFTR normale.

La tecnica scoperta da questi ricercatori (1) e perfezionata nel nuovo lavoro (2) interviene all’interno del nucleo, quando ancora il DNA del gene deve assemblare il suo mRNA. Consiste nell’inserire e accostare a uno specifico segmento del DNA genico un piccolissimo frammento di RNA. Questi corti frammenti di RNA sono normalmente presenti nel nucleo della cellula e hanno appunto la funzione di regolare il meccanismo dello splicing e la maturazione di mRNA.

Nello studio, i ricercatori costruiscono piccolissimi RNA ingegnerizzati con sequenza su misura per la mutazione splicing che intendono trattare. Questo RNA è chiamato “Exon Specific U1 snRNA” o “ExSpeU1” (Uracile – una molecola base dell’RNA-piccolo RNA nucleare Esone Specifico). ExSpeU1 è in grado di trattare mutazioni che alterano lo splicing provocando l’anomala eliminazione di un esone. La sua azione consiste nell’agganciare le basi della sequenza del DNA a valle dell’esone interessato e agire come una cerniera che lo trattiene facendolo rimanere al suo posto.

Le mutazioni splicing prese in considerazione sono dieci: la 2789+5G>A che è frequente e attribuita alla classe 5, e le meno frequenti ma di classe 1 3120G>A, 711+5>A, 1898+3A>, 711+3A>C, 711+3A>G, 1683C>T. Inoltre anche tre combinazioni di varianti del gene, appartenenti al complesso delle varianti Poli-T e Poli-TG, che hanno effetti patologici: T5-TG12, T5-TG13, T3-TG13. Queste mutazioni provocano tutte il salto di un esone specifico del DNA, (un pezzo di informazione che viene quindi a mancare in mRNA), esone che invece viene recuperato attraverso un ExSpeU1 dedicato.

Gli esperimenti sono condotti su cellule in coltura e dimostrano che dopo l’inserimento di ExSpeU1 viene prodotto normale mRNA e normale proteina CFTR. I ricercatori stimano che circa 40 mutazioni con difetto di splicing delle 352 attualmente incluse nel database CFTR2.org e classificate come causanti malattia potrebbero essere trattate con questo approccio.

Come per altri interventi di terapia genica, un problema importante è il sistema di trasporto di ExSpeU1 all’interno della cellula; in precedenti lavori in cellule staminali epiteliali FC sembra essere stato affrontato efficacemente per mezzo di virus della famiglia dei Lentivirus. Trovato il vettore adatto, si tratta di passare a esperimenti su modelli animali o tessuti ex-vivo. È interessante notare che la stessa tecnica si può applicare a mutazioni con difetto di splicing responsabili di Atrofia Muscolare Spinale: in questa malattia ne è già stata dimostrata l’efficacia in modelli animali.
La ricerca è stata realizzata con il contributo di FFC (progetto FFC#5/2014) e della CFF-USA.

1) Scoperta nuova strategia per correggere effetti di mutazioni CFTR splicing, 06/03/2012
2) Donegà S, Malgorzata R, Pianigiani G, Igreja S. Amaral D and Pagani F. Rescue of common exon skipping mutations in Cystic Fibrosis with modified U1 snRNAs. Hum Mutat. 2020 Sep 15