I principali obiettivi di questo progetto (continuazione di FFC#13/2017) sono di indagare sul ruolo degli antibiotici nello sviluppo di forme vitali ma non coltivabili (VBNC) di Pseudomonas aeruginosa (Pa), implicate nella riattivazione dell’infezione, e mettere a punto un protocollo di citometria a flusso per la conta delle cellule vitali totali (CVT) nei campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica. Le cellule VBNC sono infatti date dalla differenza tra CVT e cellule coltivabili.  Biofilm in vitro di Pa sono stati esposti a antibiotici quali ceftazidime, ciprofloxacina, colistina (COL), fosfomicina, meropenem (MER), tobramicina (TOB), ceftolozano/tazobactam (C/T) e ceftazidime/avibactam (CZA) e le conte batteriche sono state effettuate mediante la tecnica colturale di routine e qPCR/citometria di flusso.
La persistenza delle forme VBNC era favorita dal trattamento con TOB e con beta-lattamici (BL), escluso CZA. Dei due protocolli di citometria a flusso sviluppati, basati sull’uso di anticorpi o di una sonda specie-specifica, il secondo ha dimostrato la richiesta specificità e risultati in accordo con quelli dell’analisi qPCR. La sua sensibilità è risultata scarsa a causa della matrice del campione, è pertanto da considerarsi affidabile per il rilevamento qualitativo di Pa, ma non per la sua quantificazione, meglio ottenuta con qPCR.
Per correlare la presenza di Pa-VBNC con lo stato infettivo e il trattamento antibiotico in vivo abbiamo analizzato 50 campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica provenienti da 22 pazienti. Pa-VBNC è stato rilevato in 28 campioni da 15 pazienti, di cui 12 con infezioni croniche. Il trattamento con TOB, BL e le loro combinazioni (incluse TOB+C/T o CZA) è associato alla persistenza di Pa-VBNC, quello con COL, C/T e CZA alla sua assenza e quello con COL+TOB o MER alla sua persistenza in assenza di cellule coltivabili.

In conclusione, la presenza di cellule VBNC di Pseudomonas aeruginosa in campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica è stata confermata mediante la tecnica di citometria di flusso e la persistenza di una sottopopolazione VBNC è risultata associata in particolare ai pazienti cronici e al trattamento con TOB e BL, confermando quanto osservato in vitro.

Scarica qui la scheda della Ricerca trasparente FFC#16/2019

• Mangiaterra, Gianmarco et al. Contribution of Drugs Interfering with Protein and Cell Wall Synthesis to the Persistence of Pseudomonas aeruginosa Biofilms: An In Vitro Model. International journal of molecular sciences vol. 22,4 1628. 5 Feb. 2021
• King, John et al. Pseudomonas aeruginosa in the Cystic Fibrosis Lung. Advances in experimental medicine and biology vol. 1386 (2022): 347-369
• Mangiaterra, Gianmarco et al. Role of Tobramycin in the Induction and Maintenance of Viable but Non-Culturable Pseudomonas aeruginosa in an In Vitro Biofilm Model. Antibiotics (Basel, Switzerland) vol. 9,7 399. 10 Jul. 2020