Il progetto si propone di identificare i possibili bersagli biologici e il meccanismo d’azione di ARN23765, un correttore di CFTR scoperto dal nostro gruppo di ricerca all’interno del progetto Task Force for Cystic Fibrosis, che ha mostrato un’elevata potenza nel ristabilire la funzione della proteina CFTR mutata in cellule epiteliali bronchiali da pazienti con la mutazione F508del/F508del. Nonostante i dimostrati effetti biologici, il meccanismo d’azione di ARN23765 non era stato ancora del tutto caratterizzato. Per studiare i bersagli biologici e il meccanismo d’azione di ARN23765 in cellule viventi, i ricercatori hanno usato un particolare approccio biochimico, noto come Photo-Affinity Labeling (PAL). Questa tecnica è basata sulla sintesi di sonde chimiche strutturalmente correlate a ARN23765. Una sonda chimica è una piccola molecola capace di legarsi in modo reversibile a un bersaglio biologico; in questo caso, le sonde sono caratterizzate anche dalla presenza di una porzione fotoreattiva (cioè che reagisce alla luce) e di un gruppo chimico capace di legarsi a un marcatore molecolare (per seguirne il percorso). Sono state così progettate e sintetizzate alcune sonde foto-attivabili che sono state poi somministrate in colture di cellule esprimenti CFTR nativa o mutata (F508del). Le cellule sono state poi esposte alla luce UV per consentire alle sonde di legarsi in maniera stabile alle biomolecole con cui interagivano. Il marcatore legato alla sonda ha consentito di rilevare e/o isolare i complessi sonda-bersaglio, e quindi ha permesso di identificare i possibili bersagli mediante tecniche sperimentali di elettroforesi di proteine su gel e/o spettrometria di massa. I dati ottenuti hanno dimostrato che le sonde foto-attivabili derivate da ARN23765 si legano a CFTR in cellule intatte, indicando che ARN23765 può ragionevolmente agire direttamente su CFTR. Questo risultato è di indubbio interesse poiché rivela per la prima volta l’interazione di un modulatore con CFTR in un ambiente biologico integro. Inoltre, tale metodologia ha permesso di identificare alcune interessanti proteine (attualmente in fase di valutazione) capaci di interagire con CFTR, che potrebbero rappresentare ulteriori bersagli di ARN23765.
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Abstract presentati a congressi scientifici
- Characterization of CFTR modulators mechanism of action via Photo-Affinity Labeling (PAL) approach. 17th ECFS Basic Science Conference, Albufeira (Portugal), 30 March-02 April 2022
- Characterization of corrector ARN23765 mechanism of action via Photo-Affinity Labeling (PAL) approach 17th ECFS Basic Science Conference, Albufeira (Portugal), 30 March-02 April 2022
- Towards the characterization of corrector ARN23765 mechanism of action via Photo-Affinity Labeling (PAL) approach. XXVII National Meeting in Medicinal Chemistry (Società Chimica Italiana), Bari, 11-14 September 2022