I principali obiettivi di questo progetto (continuazione di FFC#13/2017) sono di indagare sul ruolo degli antibiotici nello sviluppo di forme vitali ma non coltivabili (VBNC) di Pseudomonas aeruginosa (Pa), implicate nella riattivazione dell’infezione, e mettere a punto un protocollo di citometria a flusso per la conta delle cellule vitali totali (CVT) nei campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica. Le cellule VBNC sono infatti date dalla differenza tra CVT e cellule coltivabili. Biofilm in vitro di Pa sono stati esposti a antibiotici quali ceftazidime, ciprofloxacina, colistina (COL), fosfomicina, meropenem (MER), tobramicina (TOB), ceftolozano/tazobactam (C/T) e ceftazidime/avibactam (CZA) e le conte batteriche sono state effettuate mediante la tecnica colturale di routine e qPCR/citometria di flusso.
La persistenza delle forme VBNC era favorita dal trattamento con TOB e con beta-lattamici (BL), escluso CZA. Dei due protocolli di citometria a flusso sviluppati, basati sull’uso di anticorpi o di una sonda specie-specifica, il secondo ha dimostrato la richiesta specificità e risultati in accordo con quelli dell’analisi qPCR. La sua sensibilità è risultata scarsa a causa della matrice del campione, è pertanto da considerarsi affidabile per il rilevamento qualitativo di Pa, ma non per la sua quantificazione, meglio ottenuta con qPCR.
Per correlare la presenza di Pa-VBNC con lo stato infettivo e il trattamento antibiotico in vivo abbiamo analizzato 50 campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica provenienti da 22 pazienti. Pa-VBNC è stato rilevato in 28 campioni da 15 pazienti, di cui 12 con infezioni croniche. Il trattamento con TOB, BL e le loro combinazioni (incluse TOB+C/T o CZA) è associato alla persistenza di Pa-VBNC, quello con COL, C/T e CZA alla sua assenza e quello con COL+TOB o MER alla sua persistenza in assenza di cellule coltivabili.
In conclusione, la presenza di cellule VBNC di Pseudomonas aeruginosa in campioni di espettorato da persone con fibrosi cistica è stata confermata mediante la tecnica di citometria di flusso e la persistenza di una sottopopolazione VBNC è risultata associata in particolare ai pazienti cronici e al trattamento con TOB e BL, confermando quanto osservato in vitro.
This project (which follows up on project FFC#13/2017) aims to provide information on the role of antibiotics in the development of viable but non-culturable (VBNC) P. aeruginosa (Pa) forms and to develop a flow cytometry (FC) protocol to support qPCR in detecting VBNC cells (i.e., the difference between total viable and culturable cells), which are responsible for lung infection recurrence.
In vitro GFP-expressing Pa biofilms were exposed to ceftazidime, ciprofloxacin, colistin (COL), fosfomycin, meropenem (MER), tobramycin (TOB), ceftolozane/tazobactam (C/T) and ceftazidime/avibactam (CZA). Viable Pa cells were detected by culture, qPCR and FC. TOB and all cell wall-targeting drugs, except CZA, favoured the development and persistence of VBNC forms.
A species-specific FC protocol was then developed to detect VBNC Pa cells in clinical samples. The protocol was first validated using in vitro Pa biofilms. Its specificity was confirmed using samples containing different cystic fibrosis (CF) pathogens; sensitivity was hampered by the sample matrix. The protocol thus proved reliable for PA infection diagnosis, but not for pathogen quantification, which was better achieved by qPCR. To correlate the presence of VBNC Pa cells with infection status and antibiotic treatment, we analysed 50 sputum samples from 22 intermittent or chronic patients. VBNC forms were found in 28/50 from15 patients (12 chronic). The results showed a persistence in VBNC cells after treatment with TOB, β-lactams and their combinations (including TOB+ C/T or CZA), their absence after treatment with COL, C/T or CZA and their presence (in the absence of culturable cells) after treatment with COL + TOB/MER.
In conclusion, FC and qPCR provided similar results on VBNC Pa cell detection in CF (including culture-negative) samples. The persistence of a VBNC Pa subpopulation seems to be a feature of chronic patients, related to treatment with aminoglycosides and β-lactams, in line with in vitro findings.
