Questo studio si focalizza sulle mutazione di splicing del gene CFTR ed in particolare su alcune mutazioni che causano un difetto chiamato exon skipping o salto dell’esone (viene saltata una grossa parte del codice genetico nel suo trasferimento per la sintesi, attraverso RNA, di proteina CFTR). Lo studio si basa su osservazioni preliminari che mostrano come in vitro piccole molecole di RNA presenti nel nucleo della cellula, chiamate ExSpeU1 (Exon Specific U1s), sono in grado di correggere l’exon skipping. L’obiettivo è quello di sviluppare una nuova strategia terapeutica rivolta alle mutazioni splicing. Perciò sarà necessario: 1) identificare diversi ExSpeU1 attivi sul gene CFTR in grado di correggere più mutazioni di splicing: questo richiederà la creazione di appropriati “minigeni” in grado di intervenire nella maggior parte dei 27 esoni che compongno il gene CFTR; 2) attraverso l’analisi dei meccanismi coinvolti, sviluppare molecole con migliore attività; 3) studiarne l’effetto sulla funzionalità del canale CFTR in cellule geneticamente modificate in modo che contengano mutazioni CFTR splicing.
A significant proportion of disease-causing mutations in CFTR gene affect pre-mRNA splicing, inducing skipping of the exon from the mature transcript. In these cases, a therapeutic splicing rescue that improve exon definition and induce inclusion of the defective exon in the final transcript is expected to correct the basic defect and restore normal CFTR function. This project aims to explore a novel RNA-based repair strategy for mis-splicing in CFTR gene, based on Exon Specific U1 snRNA (ExSpe U1). ExSpe U1s are modified U1 snRNAs whose specific binding in intronic sequences downstream the 5’ss are able to rescue splicing of defective exons. We recently demonstrated that a single ExSpe U1 is able to efficiently correct multiple splicing defects in CFTR exon 12 minigene. In this project, we intend: 1) to evaluate the efficacy of the approach to correct aberrant splicing in different CFTR defective exons; 2) to improve the ExSpeU1 efficacy through the investigation of the molecular mechanisms involved; 3) to investigate the ExSpeU1 rescue on the CFTR protein function through the development of appropriate cellular models based on splicing competent minigenes and splicing-defective modified cells.
