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Recensione di pubblicazione da progetto FFC

19 Ottobre 2020

Nuova via per il trattamento delle mutazioni splicing ancora prive di farmaci

G. Borgo

Successo di esperimenti in vitro con tecnica molecolare ad alta precisione.

Il gruppo di ricerca coordinato da Franco Pagani, del Centro Internazionale di Ingegneria Genetica e Biotecnologie (ICGEB) di Trieste, continua gli studi iniziati alcuni anni fa su di un gruppo di mutazioni chiamate splicing. Esse rappresentano circa il 10-12% di tutte le mutazioni del gene CFTR, non hanno ancora un farmaco specifico disponibile, comportano gravità variabile di sintomi perché possono appartenere sia alla classe funzionale 1 (severe) che 5 (benigne).

Lo splicing è quel processo per cui dall’intera sequenza di un gene si passa, attraverso il riassemblaggio di alcuni suoi frammenti (gli esoni) e l’eliminazione di altri (gli introni), a una sequenza molto più breve: RNA messaggero o mRNA. È questo il responsabile della trasmissione del messaggio del gene per la sintesi della proteina CFTR: se mRNA è normale, sarà prodotta CFTR normale.

La tecnica scoperta da questi ricercatori (1) e perfezionata nel nuovo lavoro (2) interviene all’interno del nucleo, quando ancora il DNA del gene deve assemblare il suo mRNA. Consiste nell’inserire e accostare a uno specifico segmento del DNA genico un piccolissimo frammento di RNA. Questi corti frammenti di RNA sono normalmente presenti nel nucleo della cellula e hanno appunto la funzione di regolare il meccanismo dello splicing e la maturazione di mRNA.

Nello studio, i ricercatori costruiscono piccolissimi RNA ingegnerizzati con sequenza su misura per la mutazione splicing che intendono trattare. Questo RNA è chiamato “Exon Specific U1 snRNA” o “ExSpeU1” (Uracile – una molecola base dell’RNA-piccolo RNA nucleare Esone Specifico). ExSpeU1 è in grado di trattare mutazioni che alterano lo splicing provocando l’anomala eliminazione di un esone. La sua azione consiste nell’agganciare le basi della sequenza del DNA a valle dell’esone interessato e agire come una cerniera che lo trattiene facendolo rimanere al suo posto.

Le mutazioni splicing prese in considerazione sono dieci: la 2789+5G>A che è frequente e attribuita alla classe 5, e le meno frequenti ma di classe 1 3120G>A, 711+5>A, 1898+3A>, 711+3A>C, 711+3A>G, 1683C>T. Inoltre anche tre combinazioni di varianti del gene, appartenenti al complesso delle varianti Poli-T e Poli-TG, che hanno effetti patologici: T5-TG12, T5-TG13, T3-TG13. Queste mutazioni provocano tutte il salto di un esone specifico del DNA, (un pezzo di informazione che viene quindi a mancare in mRNA), esone che invece viene recuperato attraverso un ExSpeU1 dedicato.

Gli esperimenti sono condotti su cellule in coltura e dimostrano che dopo l’inserimento di ExSpeU1 viene prodotto normale mRNA e normale proteina CFTR. I ricercatori stimano che circa 40 mutazioni con difetto di splicing delle 352 attualmente incluse nel database CFTR2.org e classificate come causanti malattia potrebbero essere trattate con questo approccio.

Come per altri interventi di terapia genica, un problema importante è il sistema di trasporto di ExSpeU1 all’interno della cellula; in precedenti lavori in cellule staminali epiteliali FC sembra essere stato affrontato efficacemente per mezzo di virus della famiglia dei Lentivirus. Trovato il vettore adatto, si tratta di passare a esperimenti su modelli animali o tessuti ex-vivo. È interessante notare che la stessa tecnica si può applicare a mutazioni con difetto di splicing responsabili di Atrofia Muscolare Spinale: in questa malattia ne è già stata dimostrata l’efficacia in modelli animali.
La ricerca è stata realizzata con il contributo di FFC (progetto FFC#5/2014) e della CFF-USA.

1) Scoperta nuova strategia per correggere effetti di mutazioni CFTR splicing, 06/03/2012
2) Donegà S, Malgorzata R, Pianigiani G, Igreja S. Amaral D and Pagani F. Rescue of common exon skipping mutations in Cystic Fibrosis with modified U1 snRNAs. Hum Mutat. 2020 Sep 15